Ligaatiolaskin

Kategoria: Biologia
- huhtikuu 04, 2025
| |

Vektori DNA

Insert DNA

Ligaatioreaktioasetelma

Suositeltu insertin määrä
8.3 ng
0.33 μL inserttiä
Vektorin määrä
50 ng
Käyttämällä 1 μL vektoriainesta
Insert:Vektori suhde
3:1 (moolari)
Optimaalinen standardikloonaukseen

Kokonainen reaktioasetelma

Komponentti Tilavuus (μL) Lopullinen määrä
Vektori DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA-ligaasipuskuri 2.0 1×
T4 DNA-ligaasi 1.0 400 U
Yhdisteetön vesi 15.67 20 μL:iin
Kokonaismäärä 20.0

Optimointivinkit

Perustuen syöttämiisi parametreihin, tässä on joitakin suosituksia:

  • 5' tarttuville päille, joissa vektori:insert suhde on 1:3, inkuboidaan 16°C:ssa 4 tuntia.
  • CIP-käsittely vektorille auttaa vähentämään itseligaation taustaa.
  • Jos transformaatiotehokkuus on alhainen, kokeile nostaa insert:vektori suhdetta 5:1.
  • Sileiden päiden ligaatioissa, lisää ligaasin konsentraatiota ja pidennä ligaatiotaikaa.
  • Kuumenna ligaasi 65°C:ssa 10 minuutin ajan ennen transformaatiota parhaiden tulosten saavuttamiseksi.

Tietoa DNA-ligaatiosta

  • DNA-ligaatio sisältää DNA-fragmenttien yhdistämisen fosfodiesterisidosten muodostamisen kautta.
  • T4 DNA-ligaasi tarvitsee ATP:tä ja Mg²⁺:a toimiakseen oikein (tarjotaan ligauspuskurissa).
  • Tarttuvien päiden ligaatiot ovat tehokkaampia kuin sileiden päiden ligaatiot.
  • Vektori:insert moolarisuhteet vaihtelevat tyypillisesti 1:3 - 1:5 standardikloonauksessa.
  • Korkeammat insert:vektori suhteet (3:1 - 10:1) suositellaan sileiden päiden ligaatioihin tai suurempiin inserteihin.
  • Vektorien defosforylaatio (käyttäen CIP:tä, SAP:ia jne.) estää vektorin itseligaation.
  • Nopeat ligaasijärjestelmät voivat vähentää ligaatiotaikaa 5-15 minuuttiin huoneenlämmössä.

Kaava lisättävän määrän (ng) laskemiseen:

\[ \text{Lisää ng} = \left( \frac{\text{Vektori ng} \times \text{Lisäyksen koko kb:ssä}}{\text{Vektorin koko kb:ssä}} \right) \times \left( \frac{\text{Lisäyksen moolit}}{\text{Vektorin moolit}} \right) \]

What is the Ligation Calculator?

Ligation Calculator on työkalu, joka auttaa tutkijoita määrittämään oikean määrän vektoria ja lisättävää DNA:ta, joka tarvitaan onnistuneeseen ligaatioreaktioon. DNA-ligaatiolla on keskeinen rooli molekyylikloonauksessa, jossa DNA-lisä liitetään plasmidivektoriin DNA-ligaasi-nimisen entsyymin avulla.

How Does It Work?

Tämä laskin mahdollistaa käyttäjien syöttää tietoja vektoristaan ja lisäyksestään, mukaan lukien pituus ja pitoisuus. Valitun moolisuhteen perusteella se laskee tarvittavan lisättävän DNA:n määrän optimaalisen ligaatioreaktion saavuttamiseksi.

Key Features

  • Laskee vektori-lisä moolisuhteita eri kloonaustilanteissa.
  • Tukee sekä standardeja että mukautettuja moolisuhteita.
  • Antaa suosituksia ligaatio-olosuhteista tarttuvassa tai tylppäpäisessä kloonauksessa.
  • Sisältää optimointivinkkejä ligaatioefektiivisyyden parantamiseksi.

How to Use the Calculator

  1. Syötä vektorin pituus (bp) ja pitoisuus (ng/μL).
  2. Syötä lisäyksen pituus (bp) ja pitoisuus (ng/μL).
  3. Valitse haluttu vektori-lisä moolisuhde (esim. 1:3, 1:5).
  4. Määritä kokonaisreaktiotilavuus (esim. 20 μL).
  5. Edistyneitä asetuksia varten valitse ligaatio lämpötila, kesto, ligaasi tyyppi ja vektorin käsittelyvaihtoehdot.
  6. Napsauta "Laske" saadaksesi suositellun lisättävän määrän ja reaktiokokoonpanon.

Frequently Asked Questions

What is the optimal vector-to-insert molar ratio?

Tarttuvissa ligaatioissa suositellaan yleensä 1:3 tai 1:5 vektori-lisä suhdetta. Tylppäpäisissä ligaatioissa korkeampi suhde (esim. 1:5 - 1:10) voi parantaa tehokkuutta.

Why is vector dephosphorylation recommended?

Dephosphorylaatio (käyttäen CIP, SAP tai Antarktinen fosfataasi) estää vektorin itseligaatioita, vähentäen ei-toivottuja taustakolonioita.

What ligation conditions should I use?

  • 16°C neljä tuntia – Standardiolosuhteet T4 DNA-ligaasille.
  • Huoneenlämmössä 15 minuuttia – Sopii Quick Ligase:lle.
  • Yön yli 16°C – Suositeltu haastaville ligaatioille tai tylppäpäiselle kloonaukselle.

How can I improve ligation efficiency?

  • Varmista oikea moolisuhde vektorin ja lisäyksen välillä.
  • Käytä tuoretta DNA-ligaasia ja puskuria.
  • Optimoi ligaatio-olosuhteet (lämpötila ja kesto).
  • Vahvista lisäyksen läsnäolo geeli-elektroforeesilla ennen ligaatioita.

Why Use This Calculator?

Tämä Ligation Calculator yksinkertaistaa DNA-ligaatioreaktioiden asetusta, auttaen tutkijoita määrittämään oikeat määrät vektoria ja lisäystä tehokasta kloonausta varten. Automaattisten laskentojen ja optimointivinkkien tarjoamisen ansiosta se säästää aikaa ja lisää ligaatioexperimenteiden onnistumisprosenttia.