Annealing-lämpötilalaskin

Kategoria: Biologia

- huhtikuu 04, 2025

| |

Etusiteen sekvenssi (5' to 3'):

Pituus: 20 bp GC: 50%

Takaisinsiteen sekvenssi (5' to 3'):

Pituus: 20 bp GC: 50%

Laskentamenetelmä:

Annealing-lämpötilan tulokset

Suositeltu annealing-lämpötila

56.0°C

Lasketut sulamislämpötila (Tm)

60.0°C

Annealing-lämpötilan alue

53.0°C - 59.0°C

Käytetty menetelmä

Peruskaava (2°C × (A+T) + 4°C × (G+C))

Lämpötila-alue (°C)

45 50 55 60 65 70 75

Optimointihuomiot

Perustuen siteesi ominaisuuksiin, harkitse seuraavia:

Siteesi pituus (18-30 nt) on useimpien PCR-sovellusten optimaalinen alue.
GC-pitoisuutesi (40-60%) on useimpien PCR-sovellusten optimaalinen alue.
Optimaalisten tulosten saavuttamiseksi suorita lämpötilagradientti PCR ehdotetun annealing-lämpötilan ympärillä (±3°C).
Varmista siteen spesifisyys käyttämällä in silico -työkaluja, kuten BLAST, ennen tilaamista.
Harkitse itsensä täydentävyyden tarkistamista erikoistyökaluilla, jos koet heikkoa amplifikaatiota.

Tietoa annealing-lämpötiloista

Annealing-lämpötila on tyypillisesti 3-5°C alle siteiden sulamislämpötilan (Tm).
Liian matala: Voi johtaa epäspesifiseen sitoutumiseen ja ei-toivottuihin tuotteisiin.
Liian korkea: Voi johtaa tehottomaan siteen sitoutumiseen ja alhaiseen saantoon.
Erilaisilla Tm-arvoilla varustettujen siteiden kohdalla käytä alhaisempaa Tm:ää alkuperäisissä testeissä.
Harkitse touchdown PCR:ää merkittävästi erilaisilla Tm-arvoilla varustettujen siteiden kohdalla.
Jotkut lisäaineet (kuten DMSO) voivat alentaa annealing-lämpötilan vaatimuksia.
Varmista aina gradientti PCR:llä, kun se on mahdollista, optimaalisten tulosten saavuttamiseksi.

Annealing-lämpötilan laskuri on työkalu, joka auttaa tutkijoita ja tutkijoita määrittämään optimaalisen annealing-lämpötilan PCR:lle (polymeraasiketjureaktio). Tämä varmistaa tehokkaan alukkeen sitoutumisen ja tarkan DNA:n amplifikaation.

Annealing-lämpötila ( $T_{a}$ ) lasketaan tyypillisesti alukkeen sulamislämpötilan ( $T_{m}$ ) perusteella:

$T_{a} = T_{m} - 3 °C to T_{m} - 5 °C$

Perussulamislämpötilan ( $T_{m}$ ) laskenta:

$T_{m} = 2 (A + T) + 4 (G + C)$

Vaihtoehtoisesti käytetään suolatasapainotettua kaavaa tarkkuuden lisäämiseksi:

$T_{m} = 81.5 + 0.41 (% G C) - (675 / L) + 16.6 \log_{10} [{Na}^{+}]$

Missä:

$% G C$ = G- ja C-emästen prosenttiosuus alukkeessa
$L$ = Alukkeen pituus (emäsparina)
$[{Na}^{+}]$ = Suolapitoisuus mM

Kuinka käyttää laskuria

Seuraa näitä vaiheita määrittääksesi optimaalinen annealing-lämpötila PCR-kokeellesi:

Syötä etu- ja (valinnainen) takaalukesequence.
Valitse laskentamenetelmä: Perus, Lähin-naapuri tai Suolatasapainotettu.
Jos käytät suolatasapainotettua menetelmää, syötä suolapitoisuus.
Vaihtoehtoisesti vaihda Kehittyneisiin asetuksiin manuaalista alukkeen ominaisuuksien syöttämistä varten.
Napsauta "Laske" nähdäksesi sulamislämpötilan ja suositellun annealing-lämpötilan.

Miksi tämä laskuri on hyödyllinen

Tämä työkalu auttaa tutkijoita optimoimaan PCR-olosuhteita:

Estää ei-spesifistä sitoutumista: Varmistaa, että alukkeet sitoutuvat vain kohde-DNA:han.
Lisää PCR:n tehokkuutta: Määrittää parhaat olosuhteet vahvalle amplifikaatiolle.
Tukee erilaisia PCR-tyyppejä: Toimii standardi-, sisäkkäis-, qPCR- ja multiplex-PCR:ssä.
Tarjoaa mukautettuja säätöjä: Mahdollistaa hienosäädön degeneraatioon, DMSO:n käyttöön ja alukkeen pituuteen.

Usein kysytyt kysymykset

What is an annealing temperature?

Annealing-lämpötila on lämpötila, jossa alukkeet sitoutuvat kohde-DNA-sekvenssiin PCR:n aikana. Se on tyypillisesti muutaman asteen alhaisempi kuin alukkeiden sulamislämpötila ( $T_{m}$ ).

How is the melting temperature ( $T_{m}$ ) calculated?

Peruskaava on: $T_{m} = 2 (A + T) + 4 (G + C)$ , mutta kehittyneemmät mallit säätävät suolapitoisuuden ja termodynaamiset ominaisuudet mukaan.

Why do different primers require different annealing temperatures?

GC-pitoisuus, alukkeen pituus ja sekvenssikoostumus vaikuttavat sulamislämpötilaan, mikä vaatii erilaisia annealing-lämpötiloja optimaalista sitoutumista varten.

How do I determine the best annealing temperature?

Aloita laskurin suosituksesta, ja hienosäädä sitten gradientti-PCR:llä, testaten lämpötilojen vaihteluväliä (esim. $T_{m} - 5 °C$ - $T_{m}$ ).

What if my primers have very different melting temperatures?

Käytä alhaisempaa $T_{m}$ :ää alkuperäisissä testeissä. Jos ero on suuri, harkitse alukkeiden uudelleen suunnittelua tai kahden vaiheen PCR-lähestymistapaa.

How does DMSO affect annealing temperature?

DMSO alentaa tehokasta annealing-lämpötilaa vähentämällä DNA:n toissijaisia rakenteita. Laskuri säätää tätä kehittyneissä asetuksissa.

What is the advantage of the nearest-neighbor method?

Lähin-naapuri -menetelmä ottaa huomioon termodynaamiset vuorovaikutukset emäsparien välillä, mikä tekee siitä tarkemman kuin peruskaava.

Viimeiset ajatukset

Annealing-lämpötilan laskuri on arvokas työkalu PCR-olosuhteiden optimointiin, varmistaen spesifisen ja tehokkaan DNA:n amplifikaation. Varmista aina tulokset gradientti-PCR:llä parhaiden tulosten saavuttamiseksi.